Публикации

Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции

20 Января 2017
Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины»

Область применения

Настоящие клинические рекомендации устанавливают единые требования к выполнению лабораторной диагностики гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции для медицинских организаций Российской Федерации, имеющих лицензию по специальностям «Клиническая лабораторная диагностика», «Вирусология», «Бактериология», «Инфекционные болезни», «Педиатрия», «Пульмонология». Рекомендации одобренына II Российском конгрессе лабораторной медицины в городе Москве 14 октября 2016 года.

Уровень доказательности рекомендаций

Доказательной базой для рекомендаций явились публикации, вошедшие в базы данных Cochrane library, PubMed, EMBASE и MEDLINE, электронную библиотеку (www.e-library.ru). Глубина поиска составила 16 лет.

Клинические рекомендации созданы на основе согласованного мнения членов ассоциации специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины», а также обобщения опыта авторов, специалистов обществ пульмонологов России (Российское Респираторное Общество) и стран Европы (Европейское Респираторное Общество) и апробированных рекомендаций, действующих в настоящее время в Великобритании [Harris M; Lim WS] США [Bartlett JG; Mandell LA], Швеции [Regamey N].

Оценка уровня доказательности и значимости рекомендаций производилась в соответствии с данными, изложенными ниже.

Оценка уровня доказательности

Убедительные доказательства эффективности и существенной клинической пользы
Уровень рекомендацийОпределениеПрименение
AУбедительные доказательства эффективности и существенной клинической пользыНастоятельно рекомендуется
BСильные или умеренные доказательства эффективности, ограниченные клинические преимуществаКак правило, рекомендуется
СНедостаточные доказательства эффективности или эффективность незначима по сравнению с возможными неблагоприятными последствиямиНеобязательно к исполнению
DУмеренные доказательства эффективности или эффективность незначима по сравнению с возможными неблагоприятными последствиямиКак правило, не рекомендуется

Качество доказательности рекомендации

IДанные рандомизированных контролируемых клинических исследований или строго разработанных экспериментальных лабораторных исследований, выполненных независимыми исследователями
IIДанные хорошо спланированных клинических исследований без рандомизации, когортных исследований или исследований случай-контроль, аналитических исследований (предпочтительно более чем одного исследования),убедительные доказательства лабораторных экспериментов
IIIМненияавторитетных специалистов, основанные на данных клинических или лабораторных исследований, описательных исследованияхили отчетах экспертов

Уровни доказательности рекомендаций приводятся при изложении текста ниже.

Общие положения и область применения

В методических рекомендациях представленысовременныесведения о возбудителях ОРВИ, включая эпидемиологические данные о новых видахвирусов, описанных в последнее десятилетие. Представленобщий методический подход и подробный порядокпроведения лабораторного исследования методом ПЦРс целью обнаружения НК гриппа и других значимых возбудителей ОРВИ. Особое внимание уделено описанию перечня биологического материалаи правил его получения, упаковки, транспортирования и хранения биологическогоматериала от больных (умерших).

Клинические рекомендации предназначены для специалистов лабораторий, выполняющих работы c использованием методов амплификации НК при исследовании материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I-IV групп патогенности (опасности), аккредитованных в установленном порядке и имеющих лицензии на данный вид деятельности в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Введение

Заболеваемость острыми инфекциями верхних дыхательных путей (ОРВИ) множественной или неуточненной локализации и гриппом в России по данным официальной статистики (форма 1) в совокупности составляет 19-20 тыс. на 100 тыс. населения ежегодно, превышая в десятки раз аналогичные показатели для других инфекционных болезней, и составляет 90% всех регистрируемых случаев инфекционных и паразитарных болезней. Дети дошкольного возраста подвержены острым респираторным заболеваниям (ОРЗ), в среднем, 4-8 раз в год, школьники от 2 до 6 раз в год, взрослые 2-3 раза в год. В контингентах часто болеющих детей эпизоды ОРЗ регистрируются от 10 до 12 раз в год.

В 90% случаев ОРЗ вызывают возбудители ОРВИ, причиной которых могут являться представители 4-х семейств вирусов, геном которых представлен молекулой РНК (ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и пикорнавирусы) и 2-х семейств вирусов, геном которых представлен молекулой ДНК (аденовирусы, парвовирусы). Ведущее место среди острых инфекций дыхательных путей занимает грипп, возбудитель которого периодически вызывает пандемии, последняя из которых наблюдалась в 2009-2010 гг. Эпидемии гриппа охватывают от 5 до 20% населения, приводят к госпитализации порядка 3 млн. человек и вызывают до 250-500 тыс. летальных исходов в мире ежегодно [CDC. MMWR, 2010]. У взрослых больных гриппом в 10-15% случаев развиваются осложнения, причем80% из них приходится на пневмонию. При развитии пневмонии у детей вирусы гриппа обнаруживают в 7-22% случаев. Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae, в котором выделяют три рода -InfluenzavirusA, InfluenzavirusВи InfluenzavirusС, каждый из которых имеет по одному виду - InfluenzaAvirus, InfluenzaВ virusи InfluenzaС virus.

Вирусы гриппа А (Influenzavirus A), широко распространены в природе, их выделяют от большинства зверей и птиц, и по этой причине, они имеют высокий пандемический потенциал, так как способны преодолевать межвидовые барьеры. Способность вирусов гриппа А к быстрому накоплению мутаций, изменяющих их антигенные свойства, лежит в основе их высокого эпидемического потенциала. Вирусы гриппа А в настоящее время дифференцируют (типируют) с помощью генетических методов на подтипы (или субтипы) в соответствии с генетической структурой генов гемагглютинина (HА) на 16 субтипов и нейраминидазы (NА) на 9 субтипов. В 2013г.при скрининге у летучих мышей в Центральной Америке и Перу 2013г.были обнаружены новые субтипы 11 вирусов гриппа, обозначенные как H17N10 и H18N11. Значительную обеспокоенность вызывает циркуляция в природе патогенных для человека вирусов гриппа птиц. Регистрируются крупные эпизоотии,вызванные вирусами гриппа субтипов H7 и H9, сопровождаемые заболеванием людей (Гонконг –H9N2, 1998-1999 гг., Нидерланды-H7N7, 2003г.), в ряде случаев с летальным исходом. С 2005 г. эпизоотии гриппа H5N1, повлекли за собой заболевания людей в десятке стран мира с летальностью 60%. В июне 2013г. ВОЗ сообщила о 132 лабораторно-подтвержденных случаях инфекции, вызванной вирусом гриппа A/H7N9, включая 37 случаев, закончившихся летально. Таким образом, на настоящее время актуален мониторинг вирусов гриппа, имеющих в геноме сегмент, кодирующий НА субтипов H5, H7 и H9.

Вирусы гриппа В до сих пор выделяли только от людей. Наряду с гриппом А, они занимают значительную долю в структуре летальности при гриппе у детей. Так, в США в сезоне 2010-2011гг.вирус гриппа В стал причиной 38% случаев смерти детей, заняв в структуре циркулирующих вирусов гриппа 26% [CDC. MMWR., 2011].

У людей вирусы гриппа С вызывают спорадические ОРЗ. Среди животных вирусы гриппа С выделяют от свиней, при экспериментальном заражении заболеванию подвержены собаки. Вирусы гриппа А, В и С дифференцируют друг от друга с помощью иммунологических и МАНК.

Помимо гриппа, причиной ОРЗ являются парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (HumanRespiratorysyncytialvirus), метапневмовирус человека (HumanMetapneumovirus), 4 вида (1-4) вирусов парагриппа (Human Parainfluenza virus1-4), коронавирусы (Human Coronavirus 229E, Human CoronavirusOC43, Human CoronavirusNL63, Human CoronavirusHKUI), риновирусы (Rhinovirus) виды А, В, С, относящиеся к пикорнавирусам, аденовирусы (Human mastadenovirus) виды B, C, E, бокавирус человека (Human bocavirus), относящийся к парвовирусам. Все вышеперечисленные вирусы вызывают ОРЗ среди всех возрастных групп, за исключением бокавируса человека, инфицирующего только детей. У лиц со сниженной активностью иммунной системы, причиной ОРЗ могут быть также энтеровирусы, вирусы герпеса, цитомегаловирус. Дифференциальная диагностика гриппа и других ОРВИ возможна только с помощью лабораторных методов исследования.

Респираторно-синцитиальный вирус (hRSv, РС-вирус) является основным возбудителем бронхиолитов и пневмоний у младенцев и детей младшего возраста во всем мире [Nair H; Stockman LJ]. Частота hRSv у больных внебольничной пневмонии детей колеблется от 15,7% до 31,8% в зависимости от региона эпидемического сезона и возраста и максимальна у госпитализированных детей первого года жизни [Rohde GGU; Harris M]. В группу риска тяжелого течения PC-инфекциивходят недоношенные младенцы, дети до 2-х лет, дети и взрослые с ослабленной вследствие заболеваний или лечения иммунной системой, пожилые люди (старше 65 лет). В годы эпидемической активности hRSv составляет 44% в этиологической структуре острых бронхитов у госпитализированных детей [Яцышина С.Б., 2008].

Клинико-эпидемиологические исследования инфекции, вызванной метапневмовирусом (hMPv), впервые обнаруженным в 2001г., демонстрируют сходство клинической картины с RSv-инфекцией. Исследования специфических антител к вирусу в разных популяциях свидетельствуют о широкой распространенности hMPv, практически все дети имеют такие АТ к 5 годам жизни. MPv-инфекция составляет от 5 до 25% случаев госпитализаций с острой инфекцией нижних дыхательных путей детей младшего возраста [Edwards KM]. Основными диагнозами hMPv-инфекции у детей являются бронхиолиты, пневмония и бронхиальная астма. У детей при пневмонии метапневмовирус обнаруживают в 8-14,5% случаев [Williams JV, 2010; Rohde GGU]. hMPv, как и hRSv, могут служить причиной групповых заболеваний в домах малютки и домах престарелых, вызывая заболевания нижних дыхательных путей (до 79%) и приводя к летальным исходам (до 11%) [CDC. MMWR. 2013].

Вирусы парагриппа (hPiv) разделяют на 4 вида, относящиеся к двум родам: респировирусы (парагрипп 1 и 3) и рубулавирусы (парагрипп 2 и 4). Вирусы парагриппа часто обнаруживаются у детей младшего возраста. Ко второму году жизни каждый ребенок хотя бы один раз переболевает ОРЗ, вызванным вирусами парагриппа. hPiv 2 и 4 чаще обнаруживают у детей первого года жизни по сравнению с другими возрастными группами, где превалируют вирусы парагриппа 1 и 3. Доля hPiv в этиологической структуре ОРЗ составляет от 9 до 30%. При этом, в этиологической структуре крупов у детей первых лет жизни вирусы парагриппа 1 –4 занимают до 20%. Среди детей с заболеваниями нижних дыхательных путей, госпитализированных в стационары, инфицированные hPiv,составляют около 22% [Weinberg GA]. Все это ставит вирусы парагриппа на второе место среди возбудителей ОРВИ по частоте госпитализации и тяжести заболевания после респираторно-синцитиального вируса.

Среди аденовирусов (hAdv) выделяют 7 видов: A, B, C, D, E, F, G. В зависимости от вида,аденовирусы вызывают различные инфекционные заболевания: конъюнктивиты и кератоконъюнктивиты (A, D), острые диарейные заболевания (F), гастроэнтериты (G), крупы, гриппоподобные заболевания, бронхиты и пневмонии – B, C, E. Известны случаи бессимптомного носительства hAdv в лимфоидной ткани верхних дыхательных путей на протяжении нескольких месяцев и лет, которые могут быть источником возбудителя. Будучи относительно устойчивыми к химическим и физическим воздействиям, hAdv могут длительное время сохранять стабильность в окружающей среде, и по этой причине,часто вызывают вспышки в детских дошкольных учреждения, домах ребенка, домах престарелых, и прежде всего, в воинских частях, где частота выявления hAdv достоверно превышает таковую у взрослых штатских и детей [Львов Н.И.]. При этом заболевание может протекать со случаями пневмонии тяжелого течения, и даже заканчиваться летальным исходом [Яцышина С.Б., 2014].

Коронавирусы (hCov) представляют собой большую разнообразную группу вирусов, которая классифицируется как альфа, бета и гамма коронавирусы. Различные виды коронавирусов широко распространены в природе, вызывая различную инфекционную патологию у животных: гастроэнтериты и респираторные инфекции у свиней, инфекционный бронхит кур, энтериты у собак, инфекционный перитонит у кошек. Как показали исследования последних двух лет, летучие мыши инфицированы разнообразными альфа-и бета-коронавирусами. У человека острую респираторную инфекцию вызывают 4 вида коронавирусов: 229E, OC43, NL63, HKUI, чаще протекающую с поражением верхних дыхательных путей легкой или средней тяжести [Bradburne AF], и в редких случаях – с инфекциями нижних дыхательных путей [Woo PC]. Коронавирусы обнаруживаются преимущественно у детей младшего возраста с симптоматикой крупа иларингита [vander HoekL]. У детей старшего возраста и у взрослых при коронавирусной инфекции может отмечаться гриппо-подобная симптоматика, а также кашель и ринорея.

В настоящее время семейство коронавирусов включает 2 вида вирусов, вызывающих тяжелую респираторную инфекцию у людей: SARS-Cov (Severe acute respiratory syndrome coronavirus, или ТОРС-коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром) и MERS-Cov (Middle East respiratory syndrome coronavirus, или БВРС-коронавирус, вызывающий Ближневосточный респираторный синдром). Коронавирус ТОРС вызвал эпидемию в 2003 году в 33 странах мира (наибольшее количество заболевших было зарегистрировано в Китае, Сингапуре и Канаде), с общим числом заболевших 7761 человек, у 623 из них заболевание закончилось летальным исходом [Memish ZA]. Вирус SARS-Cov легко передается от человека к человеку. С сентября 2012 г. на Ближнем Востоке регистрируются случаи новой инфекции, вызванные коронавирусом MERS-Cov, летальность по данным ВОЗ составляет порядка 43%. Предполагают, что инфицирование людей происходит при контакте с верблюдами или с контаминированными вирусом объектами окружающей среды в домашнем хозяйстве или при посещении животноводческих ферм. Подтверждена возможность передачи MERS-Covот человека к человеку при близком и длительном контакте, что может провоцировать вспышки внутрибольничной инфекции в человеческой популяции [Assiri AD]. Природным резервуаром обоих вирусов являются летучие мыши.

Самым распространенным возбудителем ОРВИ среди взрослого населения и детей всех возрастных групп являются риновирусы (hRv), вызывающие воспаление слизистой верхних дыхательных путей с ринореей и кашлем; в качестве осложнения нередко развивается трахеит. Среди Rv в настоящее время выделяют 3 вида вирусов: А, В, C. Принимая во внимание тот факт, что риновирусы достаточно часто обнаруживают у детей при пневмонии [Kieninger E; Яцышина С.Б., 2016], и экспериментально доказана возможность репликации риновирусов в ткани легких млекопитающих [Schroth MK], нельзя недооценивать данный возбудитель как причину поражения нижних дыхательных путей у детей.

Бокавирус (hBov), впервые описанный в 2005 г., обнаруживается со среднегодовой частотой 1,5-19% как единственный возбудитель острой инфекции дыхательных путей у детей до 5 лет [Кондратьева Т.Ю.], вызывая лихорадку, кашель, риниты и диарею [Вартанян Р.В.]. Помимо этого, бокавирус часто обнаруживается в сочетании с другими возбудителями ОРЗ. При пневмонии у детей бокавирусы обнаруживаются в 4-15% случаев [Honkinen M; Esposito S; Яцышина С.Б., 2016]. У взрослых, находящихся в тесном контакте с больными детьми, бокавирус может вызывать легкие симптомы ОРЗ [Кондратьева Т.Ю.], в редких случаях вирус обнаруживается при пневмонии на фоне иммунодефицита.

Наиболее тяжело протекают острые инфекции дыхательных путей, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом, метапневмовирусом, вирусами парагриппа и коронавирусами, у детей в возрасте до 5 лет, пожилых и у лиц с иммунодефицитом. Современные данные свидетельствуют, что случаи инфекций нижних дыхательных путей вирусной этиологиине следует рассматривать как единичные или очень редкие. Вирусные возбудители инфекций дыхательных путей обнаруживаются у 10% пациентов ВП, нуждающихся в интенсивной терапии [Harris M].

Внедрение в клиники методов ранней этиологической лабораторной диагностики вирусных инфекций позволит клиницистам своевременно применять средства специфической противовирусной терапии, разрабатывать эффективную тактику ведения пациентовс инфекцией определенной этиологии, и тем самым, предотвращать осложнения и летальные исходы.

2. Клинические формы инфекций

2.1. Профили клинико-статистических групп заболеваний

Инфекционные болезни

  • Острые респираторные инфекции верхних дыхательных путей
  • Острые респираторные инфекции нижних дыхательных путей

Пульмонология

  • Пневмония
  • Плевральный выпот

Пульмонология + Инфекционные болезни

  • Грипп с пневмонией

Терапия +Пульмонология

  • Инфекция нижних дыхательных путей

2.2. Клинические шифры, согласно МКБ-10

  • J00 Острый назофарингит (насморк)
  • J01 Острый синусит
  • J02 Острый фарингит
    • J02.8 Острый фарингит, вызванный другими уточненными возбудителями
    • J02.9 Острый фарингит неуточненный
  • J03 Острый тонзиллит
    • J03.8 Острый тонзиллит, вызванный другими уточненными возбудителями
    • J03.9 Острый тонзиллит неуточненный
  • J04 Острый ларингит и трахеит
    • J04.0 Острый ларингит
    • J04.1 Острый трахеит
    • J04.2 Острый ларинготрахеит
  • J05 Острый обструктивный ларингит [круп] и эпиглоттит
    • J05.0 Острый обструктивный ларингит [круп]
  • J06 Острые инфекции верхних дыхательных путей множественной и неуточненной локализации
    • J06.0 Острый ларингофарингит
    • J06.8 Другие острые инфекции верхних дыхательных путей множественной локализации
    • J06.9 Острая инфекция верхних дыхательных путей неуточненная
  • J10-J18 Грипп и пневмония
  • J20-J22 Другие острые респираторные инфекции нижних дыхательных путейo
    • J20 Острый бронхит
    • J21 Острый бронхиолит
    • J22 Острая респираторная инфекция нижних дыхательных путей неуточненная
  • J40 Бронхит, не уточненный как острый или хронический
  • J90 Плевральный выпот, не классифицированный в других рубриках

3. Требования к обеспечению выполнения лабораторного исследования

3.1. Требования к специалистам и вспомогательному персоналу

Исследование имеют право проводить специалисты с высшим образованием - врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи и биологи, прошедшие первичную специализацию по клинической лабораторной диагностике и периодическое повышение квалификации в установленном порядке. Врачи и биологи должны иметь удостоверение о краткосрочном повышении квалификации «ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний» на лицензированных курсах. Требования к знаниям и умениям специалистов должны соответствовать образовательным стандартам и другим нормативным документам, действующим на территории РФ.Врачи клинической лабораторной диагностики, врачи-бактериологи, врачи-вирусологи и биологи осуществляют контроль всего технологического процесса и непосредственно выполняют этапы молекулярно-биологического исследования по выявлению НК вирусов –возбудителей гриппа и ОРВИ, требующие высокой квалификации и специальной подготовки, принимают решение о необходимости дополнительных исследований (повторное проведение исследования и т.п.). Врачи клинической лабораторной диагностики консультируют врачей-инфекционистов и помогают в интерпретации результатов исследований.

Врачи клинической лабораторной диагностики (врачи-бактериологи, биологи) должны знать:

  • все этапы подготовительной работы и проведения молекулярно-биологического исследования: правила взятия биологического материала, правила техники безопасности при работе с потенциально инфицированным биологическим материалом, требования к доставке и хранению материала, методики проведения исследования, критерии оценки результатов исследования.

Должны уметь:

  • провести молекулярно-биологическое исследование, обработать результаты.

Подготовительную работу (прием поступающих в лабораторию образцов и сопроводительных документов, регистрацию полученного биологического материала, проведение технических манипуляций, не требующих высокой квалификации: подготовка помещений, ламинарных боксов, расходных материалов, утилизация использованных расходных материалов и остатков использованных биологических образцов) выполняет специалист со средним медицинским образованием и соответствующей квалификацией (медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант), имеющий сертификат специалиста и прошедший периодическое повышение квалификации в установленном порядке.

3.2. Требования к обеспечению безопасности труда медицинского персонала

ПЦР-исследование выполняется в организациях, имеющих лицензию на осуществление медицинской деятельности, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ, выданное в установленном порядке. Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы с помощью МАНК, связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований к медицинской организации при проведении данных работ с целью предотвращения контаминации НК и/или ампликонами исследуемых проб, помещений, оборудования. Лица, отвечающие за сбор, доставку и анализ образцов биологического материала, должны руководствоваться правилами и техникой безопасности при работе с ними. Все образцы биологического материала считают потенциально опасными, т.к. могут содержать патогенные микроорганизмы.

Противоэпидемический режим в лаборатории, выполняющей ПЦР-исследование, должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.2322-08, регламентирующими работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности.

Персонал, непосредственно участвующий в проведении ПЦР-исследовании, обязан соблюдать общие правила работы в молекулярно-биологических лабораториях (МУ 1.3.2569-09,СП.1.3.2322-08)), строго придерживаться общих стандартов по формированию и поддержанию безопасности рабочей среды в медицинских лабораториях при манипуляциях с пробами пациентов, химическими реактивами и другими объектами потенциальной опасности для здоровья людей (ГОСТ Р 52905-2007).

Все сотрудники должны выполнять инструкции и правила техники безопасности, изложенные в технических паспортах к электрическим приборам, используемым в технологии (амплификаторы, центрифуги, термостаты и др.); персонал, работающий с реактивами, должен быть обучен обращению с ними, использовать средства персональной защиты, соблюдать правила личной гигиены.

Для предупреждения пожаров необходимо соблюдать правила пожарной безопасности в соответствии с действующими нормативными документами.

Сбор, временное хранение, обеззараживание и транспортировка потенциально опасных отходов, загрязненных остатками биологического материала, образующихся в процессе выполнения технологии, должна проводиться в соответствии с действующими санитарными правилами и нормами (СанПиН 2.1.7.2790-10). Отходы, содержащие (потенциально содержащие) микроорганизмы (материалы и инструменты, предметы загрязненные кровью и/или другими биологическими жидкостями) относятся к отходам класса Б, подлежат обязательному обеззараживанию (дезинфекции)/обезвреживанию. Выбор метода обеззараживания/ обезвреживания определяется возможностями организации, осуществляющей медицинскую деятельность. Отходы класса Б собираются в одноразовую мягкую (пакеты) или твердую (непрокалываемую) упаковку (контейнеры) желтого цвета или имеющие желтую маркировку. Выбор упаковки зависит от морфологического состава отходов. Реагенты, используемые для проведения экстракции нуклеиновых кислот и ПЦР, относятся к отходам класса Г. Отходы класса Г собираются в мягкую (пакеты) или твердую (непрокалываемую) упаковку (контейнеры) любого цвета, кроме красного и желтого.

Выбор упаковки зависит от морфологического состава отходов. Вывоз и обезвреживание отходов класса Г должно производиться аккредитованной организацией.Необходимо предусмотреть для обеззараживания исследуемого материала наличие автоклавной комнаты, которая может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности. Сбор, хранение и утилизация отходов проводится в соответствии с требованиями СП 2.1.7.2790-10 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

3.3. Требование к материально-техническому обеспечению выполнения исследований

Организация помещений, требования к оборудованию и правила работы в лаборатории, выполняющей исследование с помощью МАНК, должны соответствовать методическим указаниям МУ 1.3.2569-09. Согласно методическим указаниям, лаборатория, в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений:

  1. зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;
  2. зону выделения нуклеиновых кислот;
  3. зону проведения реакции амплификации и учета ее результатов при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции.

Работа лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, должна быть организована согласно СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08, МУ 1.3. 2569 -09. В лаборатории, имеющей санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III-IV группы патогенности, допускается исследование биологического материала, подозрительного на инфицирование микроорганизмами II группы патогенности только в тех случаях, для которых разработаны и утверждены нормативные документы, регламентирующие порядок проведения таких исследований в условиях данной лаборатории.

Для выполнения исследований используют стандартные оборудование, диагностические наборы реагентов, реагенты и расходные материалы, имеющие соответствующие сертификаты качества и действующий срок годности, разрешенные к применению на территории РФ в установленном порядке.

Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений, количество которых определяется используемыми МАНК согласно приложению 1.

Для проведения диагностики гриппа и других ОРВИ методом полимеразной цепной реакции, лаборатории должны быть оснащены материально-техническими ресурсами согласно приложению 2.

4. Биологический материал для исследования

Важным моментом исследования является правильный выбор, отбор, хранение и использование биологического материала. Биологический материал должен соответствовать конкретной нозологии заболевания, содержать максимальное количество возбудителя (геномавозбудителя) и быть доступным для получения неинвазивными методами. Для диагностики ОРВИ преимущественно используется биологический материал из дыхательных путей, соответствующий локализации поражения: при заболеваниях верхних дыхательных путей используются мазки из носоглотки и ротоглотки; в случае заболевания нижних дыхательных путей –материал из трахеи, бронхов и легких. При наличии выпота в плевральной полости также исследуется плевральная жидкость; при наличии менингеальной симптоматики –спинномозговая жидкость. Для диагностики отдельных инфекций могут использоваться дополнительные виды биологического материала, что указывается в инструкции к диагностическому набору. Например, для диагностики тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом ТОРС, помимо материала из респираторного тракта используются фекалии и плазма крови. При проведении исследования с целью определения этиологии ОРЗ с летальным исходом, исследуется секционный материал пораженных органов.

4.1. Перечень биологического материала для исследования

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции верхних дыхательных путей исследуются мазки со слизистой оболочки носоглотки и задней стенки ротоглотки (AI). Максимальная концентрация вирусов в этих отделах достигается на 2-й, 3-й день от момента появления симптомов заболевания (AI). В связи с этим, брать материал для исследования предпочтительно именно в эти указанные сроки. В то же время, метод ПЦР позволяет обнаружить НК возбудителя и гораздо позднее - в среднем до 7 дней, и максимум - до 2 недель от начала заболевания (при условии сохранении признаков поражения верхних дыхательных путей) (AII). Тем не менее, у госпитализированных пациентов материал для исследования следует собирать как можно раньше при поступлении (не позднее вторых суток), поскольку в более поздние сроки не исключена возможность суперинфекции при контакте с другими пациентами (AII).

Мазки со слизистых оболочек верхних дыхательных путей у пациента берут двумя разными зондами:сначала со слизистой нижнего носового хода,а затем из ротоглотки и объединяют вместе с целью повышения чувствительности исследования (AII): концы зондов с тампонами после взятия мазков последовательно помещаются в одну пробирку объемом 1,5-2 мл с 0,5 мл транспортной среды.

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей исследуется материал из нижних дыхательных путей (AI): мокрота (при глубоком откашливании), плевральная жидкость, эндотрахеальные аспираты из трахеи, получаемые с помощью хирургического (вакуумного или электрического) отсоса, бронхо-альвеолярный лаваж (БАЛ) или промывные воды бронхов, получаемые с помощью фибробронхоскопии, мокрота (откашливаемая свободно или откашливаемая после индукции ингаляцией стерильного 5% раствора натрия хлорида через небулайзер или полученная аспирацией из трахеи).

В случае невозможности получения материала из нижних дыхательных путей, при исследовании для выявления респираторных вирусов допустимо использование мазков из верхних дыхательных путей (мазки со слизистой носоглотки из нижнего носового хода и мазки со слизистой задней стенки ротоглотки) (BII).

В случае летального исхода с целью определения этиологии инфекции исследуется посмертный (аутопсийный) материал(AI).

Расходные материалы и оборудование для сбора биологического материала представлены в приложении 3.

4.2. Методика получения и условия хранения биологического материала

4.2.1. Особенности сбора проб у разных категорий пациентов

Мазки со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Мазки со слизистой оболочки носоглотки и задней стенки ротоглотки берут после полоскания полости рта кипяченой водой комнатной температуры. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. В течение 6-ти часов перед процедурой нельзя использовать медикаменты, орошающие носоглоткуили ротоглотку и препараты для рассасывания во рту.

У детей мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2–3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (AI) (3–4 см для детей). После сбора материала конец зонда с тампоном опускают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой до места слома, при этом гибкая часть зонда складывается в три раза, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают.

У взрослых мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе (допустимо использовать сухой стерильный зонд из полистирола с вискозным тампоном). Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2–3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (AI) (не менее 5 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают на глубину 1 см в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой, конец зонда отламывают, придерживая крышкой пробирки, опустив рукоятку зонда вниз. Пробирку герметично закрывают.

Мазки из ротоглотки берут сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки (AI),аккуратно прижимая язык пациента шпателем. После забора материала рабочую часть зонда стампоном помещают в пробирку с транспортной средой и зондом с мазком из носоглотки. Конец зонда с тампоном (1 см) отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Допускается хранениев течение трех суток при температуре 2–8 °С, более длительно – при температурене выше минус 16 °С (AI).

Мокроту при глубоком откашливании собирают в стерильные одноразовые герметично закрывающиеся контейнеры натощак после чистки зубов и полоскания полости рта водой. Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть, что способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты (AI). Мокроту помещают в стерильные одноразовые пластиковые контейнеры. Допускается хранениев течение 1 суток при температуреот 2 до 8 °С, более длительно-при температурене выше минус 16 °С (AI).

Получение эндотрахеального аспирата проводят натощак после чистки зубов и полоскания полости рта водой. Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть. Это способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. После присоединения мукус-экстрактора через трубку-переходник к отсосу катетер для забора трахеального аспирата вводился в глотку через полость рта. Вследствие раздражения слизистой в области голосовой щели провоцируется кашлевой рефлекс и проводится извлечение трахеального содержимого через стерильный катетер (6 или 7 размера) с помощью отсоса (например, фирмы “BlueCrossA-750” (Япония)). Объем трахеального аспирата должен составлять не менее 3-5 мл; аспират помещают в стерильные одноразовые пластиковые контейнеры. Допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно - при температуре не выше минус 16 °С (AI).

Получение индуцированной мокроты. С целью облегчения отхождения мокроты используют упражнения дыхательной гимнастики и вибрационный массаж грудной клетки. Наибольшего эффекта достигают с помощью ингаляций с использованием гипертонического раствора хлорида натрия (BII) [ZarHJ].

Перед процедурой целесообразно ввести 200 мкг сальбутамола через дозирующий ингалятор для предотвращения бронхоспазма. Затем в течение 15 минут через струйный небулайзер (аэрозольный аппарат) подается кислород со скоростью 5 л/мин с 5 мл 5% стерильного раствора NaCl. После этого проводится постукивание по передней и задней стенкам грудной клетки, с целью стимуляции отхождения мокроты. Затем пациента просят хорошо откашляться и собрать мокроту из нижних дыхательных путей (не слюну!) в стерильный контейнер. Объем образца мокроты должен быть не менее 3 мл (для взрослых и около 1 мл для детей).

У пациентов с бронхиальной астмой ингаляции должны проводиться с осторожностью, для предупреждения бронхоспазма, целесообразно предварительно провести ингаляцию 200-400мкг сальбутамола (AI).

В случае если мокрота не откашливается, процедуру рекомендуется (AI) комбинировать с последующим получением аспиратов из трахеи (эндотрахеальные аспираты) с целью извлечения содержимого из трахеи с помощью стандартного отсоса с использованием стерильного катетера 6 или 7 размера.

Допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно -при температуре не выше минус 16 °С (AI).

Аутопсийный материал забирают стерильным индивидуальным инструментом из зоны поврежденной ткани объемом 1-3 см стерильными инструментами (индивидуально для каждого органа), помещают в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры с герметично завинчивающейся крышкой, замораживают и хранятпри температурене выше минус 16 °С (AI).

Исследуется аутопсийный материал следующих органов: фрагменты пораженной части трахеи, пораженной части бронхов, пораженной части легких, выпот плевральной полости (при его наличии), фрагменты селезенки, пораженной части миокарда (при наличии поражения), мягких мозговых оболочек, коры больших полушарий (при наличии менингеальной симптоматики в анамнезе), а при наличии очаговых изменений - аутоптаты с границ данных участков.

Материал для исследования должен быть нативным (без фиксации формалином)(AI).

4.2.2. Сбор биологического материала для ПЦР с целью последующей изоляции культуры вируса

Мазки из носоглотки для вирусологической диагностики гриппа собирают стерильными зондами с вискозными тампонами со слизистой оболочки из нижнего носового хода. Зонд с тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2–3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход глубоко, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (AI) (3–4 см для детей и 5–6 см для взрослых). После взятия материала тампон, не нарушая стерильности, помещают в пробирку с 2,0–5,0 мл вирусологической транспортной среды, рекомендованной в МР «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (AI).

Взятие биологического материала с целью изоляции вирусов следует проводить не позднее трех дней от начала заболевания или в первый день госпитализации, предпочтительно до начала противовирусной терапии.

Мазки хранят в течение 24 ч при температуре 2–8° С, более длительно – при температуре не выше минус 20° С (желательно при температуре минус 70° С) (AI). Перечень зондов и сред, рекомендуемых для применения, представлен в приложении 3.

После приготовления вирусологическую транспортную среду аликвотируют в одноразовые стерильные пробирки из полипропилена стерильным наконечником в стерильных условиях (в ламинарном боксе) по 1,0 мл (при использовании пробирок объемом 1,5 мл), по 1,5 мл (при использовании пробирок объемом 2 мл), или по 2,0 мл (при использовании пробирок объемом 5-15 мл), маркируют и хранят до использования при температуре от 2 до 8 °С (AI).

Аутопсийный материал забирают стерильным индивидуальным инструментом из зоны поврежденной ткани объемом 1-3 см3 стерильными инструментами (индивидуально для каждого органа), помещают в одноразовые стерильные криопробирки с герметично завинчивающейся крышкой, замораживают и хранят при температуре не выше минус 70° С (AI).

Следует избегать оттаивания и повторного замораживания материала во время хранения и транспортирования, поскольку это приводит к утрате вирусами жизнеспособности (AI).

Транспортирование при температуре от 2 до 8° С допускается не более 24 часов. При необходимости более длительной транспортировки следует обеспечить температуру не выше минус 70° С (с использованием сухого льда (AI), при этом биологический материал должен быть помещен в криопробирки и упакован согласно руководству ВОЗ «Перевозка инфекционных материалов с сухим льдом»: http://www.who.int/ihr/Module_6_Shipping_with_dry_ice_RU.pdf).

В контейнер с целью поддержания холодовой цепи помещают одноразовый индикатор, контролирующий соблюдение требуемой температуры.

4.3. Маркировка материала для лабораторного исследования

На этикетке пробирок (контейнеров) с материалом указывается: порядковый номер образца, соответствующий номеру в сопроводительном документе, и, по возможности, фамилия и инициалы пациента, тип биоматериала.

В сопроводительном документе (направлении) к биоматериалу, собранному для исследования в лаборатории, необходимо указать:

  • наименование учреждения, которое направляет биоматериал на исследования, телефон, адрес электронной почты;
  • фамилию и имя обследуемого лица;
  • возраст или дата рождения;
  • пол;
  • дату взятия биоматериала для лабораторного исследования;
  • тип материала;
  • дату заболевания или контакта с больным;
  • предварительный клинический диагноз или повод к обследованию;
  • степень тяжести заболевания;
  • данные о вакцинации против гриппа в текущем эпидемическом сезоне (вакцинирован /не вакцинирован / нет данных);
  • ФИО, должность, сотрудника, отправившего биоматериал, дату отправки биоматериала и контактный телефон, по которому можно связаться с данным сотрудником.

4.4. Транспортирование биологического материала для проведения ПЦР-исследования

При необходимости транспортирования внутри одного здания, пробирки/контейнеры с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски.Транспортирование производится при комнатной температуре в течение 3 часов, более длительно - при температуре от 2 до 8 °С (AI).

При необходимости транспортирования биологического материала в другие организации, образцы каждого пациента помещают в индивидуальный герметичный пакет с адсорбирующим материалом и дополнительно упаковывают в общий герметичный пакет, помещаемый в термоконтейнер (AI). Транспортирование производится в термоконтейнерах при температуре от 2 до 8 °С (AI). В контейнер желательно поместить одноразовый индикатор, контролирующий соблюдение требуемой температуры.

Сопроводительные документы помещаются в индивидуальную упаковку отдельно от биологического материала и прочно прикрепляются снаружи контейнера.

4.5.Оценка приемлемости образцов

После доставки образца в лабораторию сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить правильность оформления направления на исследование, маркировку пробирок с образцами биологического материала, их целостность и зарегистрировать поступивший материал в рабочем журнале в бумажной или электронной форме. Нумерация образцов при регистрации должна быть идентична нумерации в бланках направлений на молекулярно-биологическое исследование.

Непригодными для исследования являются образцы:

  • немаркированные или несущие неверную (нечитаемую) маркировку;
  • для которых не указаны дата получения материала;
  • хранившиеся и транспортировавшиеся с нарушением требований, установленных для данного типа биологического материала;
  • с нарушением целостности и/или герметичности тары (пробирок и др.) (в т.ч. пролитые образцы).

В случае непригодности доставленного образца необходимо уведомить врача, назначившего исследование, и рекомендовать повторное взятие материала с соблюдением всех перечисленных правил.

Если повторное взятие таких образцов материала невозможно, при оформлении результата ПЦР-исследования необходимо отразить возможность влияния нарушения правил преаналитического этапа на полученный результат.

Некоторые виды биологического материала требуют предварительной обработки, заключающейся в гомогенизации (например, секционный материал) снижении вязкости (например, густая и неоднородная по консистенции мокрота) и фракционировании путем центрифугирования. Описание работ по предварительной обработке и подготовке биологического материала к исследованию представлены в приложении 4.

5. Метода лабораторной диагностики вирусных инфекций верхних и нижних дыхательных путей

5.1. Сравнение методов лабораторной диагностики

Лабораторные методы, применяемые с целью этиологической диагностики вирусных инфекций верхних и нижних дыхательных путей, подразделяют на прямые (выделение возбудителя инфекции, обнаружение генома или антигенов возбудителя) и косвенные (обнаружение специфических антител к возбудителю).

Для выделениявозбудителя инфекции применяют культуральный метод – направлен на изоляцию и идентификацию чистой культуры возбудителя инфекции. Среди вирусных возбудителей ОРЗ выделение в культуре возможно только для вирусов гриппа А и В, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 1-3 типов, метапневмовируса человека и аденовирусов, однако как рутинная процедура данный метод используется только для вирусов гриппа. Изоляция вирусов гриппа проводится в живых культурах клеток млекопитающих или на развивающихся куриных эмбрионах с последующим определением активности гемагглютинации (агглютинации вирусами эритроцитов) и идентификацией субтипов гемагглютинина (метод РТГА с типоспецифическими сыворотками) [МР «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах иих идентификация»]. Метод характеризуется достаточно большой продолжительностью, но незаменим при необходимости детального изучения патогенности, чувствительности к противовирусным препаратам, антигенных и других свойств изолятов вирусов.

Для определения антигенов вирусных возбудителей ОРЗ используют методы иммунохимии. В России используют тесты на основе иммунохроматографии для выявления антигенов вирусов гриппа и респираторно-синцитиального вируса (CII). Для обнаружения антигенов вирусов гриппа А и В используется также метод ИФА. Методы, основанные на связывании антигена с антителами, мечеными флуорохромом, результат которых оценивают с помощью люминисцентной микроскопии (РИФ, ПИФ, РПИФи др.), используют для выявления в мазках из респираторного тракта антигенов вирусных возбудителей ОРЗ, находящихся внутри клеток слизистой оболочки. Тесты на основе иммунофлуоресценции (РИФ, ПИФ, РПИФи др.) применяют (DIII) только для обнаружения антигенов вирусов гриппа, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов, вирусов парагриппа 1-3.

Такие тесты используются только в эпидемиологических целях для массового скрининга, поскольку их аналитические характеристики могут варьировать в широких пределах в зависимости от производителя, условий
хранения реагентов и навыков их использования, и по этой причинеони могут давать ложноотрицательные результаты - недовыявлять случаи инфицирования в период эпидемий (недостаточная чувствительность по сравнению с культуральными методами и ПЦР), и давать ложноположительные результаты в межэпидемический период (в силу недостаточной специфичности и субъективности интерпретации анализа) [Choi YJ; Choi WS;Tai CF].

Для выявления нуклеиновых кислот (РНК/ДНК) -фрагментов генома возбудителей острых инфекций дыхательных путей применяют МАНК, которыенаиболее эффективны и востребованы для ранней диагностики и скрининга с целью последующего получения чистой культуры возбудителя. Для рутинных исследований применяются тесты на основе ПЦР, которые обнаруживают РНК/ДНК патогенов непосредственно в биологическомматериале (AI). Максимального уровня специфичности и чувствительности достигают тесты на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени(AI). Многочисленные исследования показывают преимущество такого формата ПЦР подиагностической чувствительности и специфичности перед выявлением антигенов методами иммунохроматографии и иммунофлуоресценции при диагностике гриппа, респираторно-синцитиальной инфекции и инфекции, вызванной вирусами парагриппа 1-3 [Ganzenmueller T; Vaz-de-Lima LRA; Corne JM].

Выявление специфических антител в сыворотках крови больных ОРЗ выполняют преимущественно с использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА), иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции связывания комплемента (РСК) (BII). Диагностические наборы на основе ИФА разработаны для выявления АТ к возбудителям аденовирусной инфекции, респираторно-синцитиальной инфекции, гриппа и парагриппа. В большинстве случаев при серологической диагностике обнаруживаются АТ класса IgM и IgG или все три класса антител. Тесты в первую очередь предназначены для определения уровня специфических антител в сыворотках крови больных с целью ретроспективного подтверждения диагноза вирусных инфекций. При РС-вирусной инфекции АТ класса IgM в диагностическом титре появляются в течение недели от начала заболевания и только у 73% больных [Meurman O], в связи с чем, для диагностики этой инфекции более чувствительным и специфичным является выявление сероконверсии специфических АТ класса IgG с 4-кратным нарастанием титра [Puthavathana P] в образцах сыворотки крови, полученных последовательно в острый период заболевания и в период реконвалесценции (спустя 10-14 дней). Достоверность результата увеличивается в случае одновременного исследования обеих сывороток (AI).

Исследование диагностической эффективности выявления ДНК аденовирусов по сравнению с обнаружением специфических к hAdv АТ класса IgM, IgА и IgG в парных сыворотках при острой респираторной инфекции показало, что диагностическая чувствительность последнего составляет 57,5% [Агеева МР].

Определение специфических антител используются также для оценки уровня коллективного гуморального иммунитета и ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек.

Обнаружение антител к вирусам гриппа методом ИФА уступает по чувствительности и специфичности РТГА. Исследования во время пандемии гриппа 2009 года показали, что чувствительность обнаружения АТ класса IgМ к гемагглютинину вируса гриппа A(H1N1)pdm09 составила 53, 36 и 10% для больных до 5 лет, 6-15 лет и взрослых, соответственно. Также было показано, что для достижения специфичности требуется исследования парных сывороток крови с выявлением сероконверсии с 4-кратным нарастанием титра АТ класса IgG или IgА [LiZN], при этом чувствительность составляла 80% и 67% соответственно.

Внедрение ПЦР с детекцией флуоресценции в режиме реального времени и других МАНК произвело революцию в лабораторной диагностике респираторных вирусных инфекций благодаря своей высокой чувствительности, скорости и широкому спектру выявляемых с возможностью одновременного обнаружения нескольких возбудителей [Olofsson S].

Именно благодаря внедрению МАНК были обнаружены ранее неизвестные респираторные вирусы: метапневмовирус, бокавирус, коронавирусы (hCov HKUI и hCov NL-63 и новые риновирусы [Williams JV; Fabbiani M; Rhedin S; Pyrc K; Piralla A; Kieninger E].

В этой связи ранее используемые методы диагностики, такие как выделение вирусов в культуре клеток, обнаружение антигенов (методы ИФА или иммунофлуоресценции) в зарубежной рутинной клинической практике в большинстве лабораторий ушли в прошлое в силу своей меньшей чувствительности [Mahony JB; Johani SM; Jokela P; Beck ET].

Тесты на основе ПЦР в формате FRT позволяют обнаруживать РНК вируса гриппа А в суспензии с инфекционной активностью 0,03 lgTCID50/мл - 0,02 lgTCID50/мл и РНК вируса гриппа В в суспензии с инфекционной активностью 1lgTCID50/мл [Яцышина С.Б., 2009]. Использование в качестве мишени специфичных консервативных участков генома вирусов гриппа, обуславливает высокие показатели диагностической чувствительности ПЦР, приближающихся к 100% (90,5% - 97,6%) по сравнению с культуральной диагностикой [Bennett S; Jenny SL; Pabbaraju K].

Чувствительность ПЦР-исследования по обнаружению НК респираторных вирусов человека разных видов составляет 1000 – 10000 ГЭ (или копий) НК в 1 мл исследуемого образца.

Вместе с тем, при высокой аналитической и диагностической чувствительности ПЦР с детекцией флуоресценции в режиме реального времени обладает и высокой аналитической и диагностической специфичностью. Исследования показывают, что респираторно-синцитиальный вирус, метапневмовирус, вирусы гриппа и другие, за исключением риновирусов, очень редко (0,5% - 2,2%) обнаруживаются у взрослых и детей без симптомов ОРВИ [Brittain-Long R; Rhedin S; Jansen RR; Яцышина С.Б., 2016]. Более высокую частоту (порядка 30%) обнаружения риновирусов у условно-здоровых детей связывают с более длительным (3-6 недель) выделением вирусов из респираторного тракта после перенесенной инфекции, также не исключают наличия инаппарантной инфекции [Jansen RR; Regamey N].

5.2. Показания к применению метода полимеразной цепной реакции для этиологической диагностики гриппа и ОРВИ

Лабораторная диагностика гриппа и других ОРВИ при использовании метода ПЦР применяется для решения эпидемиологических и клинических задач. Общими показаниями для лабораторного обследования с целью проведения этиологической диагностики ОРВИ является наличие у пациента остро возникшего заболевания с локальными симптомами поражения дыхательных путей при наличии синдрома общей интоксикации.

ПЦР-анализ рекомендуется использовать в медицинских учреждениях для выяснения природы похожих по клиническим проявлениям, но отличных по этиологии, острых респираторных заболеваний в целях:

  • раннего назначения специфических средств этиотропной терапии,
  • дифференциальной диагностики с другими инфекционными болезнями,
  • своевременной госпитализации больных,
  • прогнозирования тяжести течения заболевания, возможных осложнений и исходов болезни,
  • рационального размещения больных по этиологическому принципу (во избежание перекрестного внутрибольничного инфицирования).

А также в других случаях, требующих обязательного лабораторного обследования в целях идентификации возбудителя гриппа и ОРВИ согласно СП 3.1.12.3117-13 «Профилактика гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций».

Диагностика гриппа и других ОРВИ при использовании полимеразной цепной реакции применяют для решения различных эпидемиологических задач:

  1. Определение этиологии острой инфекции верхних дыхательных путей при проведении мониторинга,
  2. Определение этиологии острой инфекции нижних дыхательных путейпри проведении мониторинга,
  3. Изучение этиологии группового заболевания ОРЗ в целях проведения соответствующих профилактических и лечебных мероприятий,
  4. Проведение исследований при подозрении на инфекцию, вызванную вирусами, относящимися к Iи II группам опасности (коронавирусы SARS, MERS, вирус гриппа птиц, высоко патогенный вирус гриппа), связанную с завозом из неблагополучных регионов мира,
  5. Лабораторное исследование с целью подтверждения случая гриппа (или другой ОРВИ) с летальным исходом,
  6. Проведение ПЦР-анализа, как ускоренного предварительного теста с целью последующего выделения культуры вируса с использованием культурального метода исследования,
  7. С целью идентификации и типирования культур вирусов.

5.3. Принцип метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция является прямым методом быстрой диагностики инфекционных болезней, позволяющим обнаруживать в качестве аналита специфичные для возбудителя инфекции участки его генома.Метод направлен на обнаружение НК вирусов и бактерий в различных типах биологического материала, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить стандартизацию процедуры исследования, контролировать процесс обработки материала на всех этапах. Высокая аналитическая чувствительность ПЦР обеспечивается за счет лежащей в основе амплификации, то есть многократного увеличения количества фрагмента НК возбудителя. Цикличность реакции достигается путем многократного (от 40 до 45 раз) последовательного повторения шагов инкубации реакционной смеси при температурах: 90-95°С (денатурация ДНК / кДНК), 50-65°С (отжиг праймеров), 60-72 °С (элонгация,или синтез цепи ДНК).

Залогом достоверности ПЦР-анализа при идентификации и субтипировании конкретного возбудителя ОРВИ является правильный выбор гена-мишени, олигонуклеотидов, комплементарных мишени и параметров ПЦР, а также экспериментальная оценка аналитических и диагностических характеристик. Поскольку вирусы подвержены большой изменчивости, гены-мишени должны быть консервативными в пределах одного вида вируса. Как правило, это гены, кодирующие матриксный протеин, нуклеопротеин, неструктурные белки, или не транслируемые области генома.

Аналитические и диагностические характеристики (специфичность и чувствительность) анализа должна обязательно оцениваться при разработке и подтверждаться при регистрации наборов реагентов, после чего они разрешаются к использованию в целях диагностики. Аналитическая чувствительность отражает минимальное количество аналита (ДНК или РНК) в пересчете на 1 мл исследуемого образца биологического материала, которое может быть обнаружено тестом в 100% случаев. Аналитическая специфичность – способность теста определять конкретный аналит в образцах, содержащих другие похожие аналиты (например, РНК или ДНК других вирусов, бактерий или человека).

Важно учитывать, что характеристики диагностических наборов, установленные разработчиком и указанные в инструкции к набору реагентов, будут воспроизводиться только при условии соблюдения всех требований и рекомендаций, включая использование оборудования, комплектов реагентов, соблюдение всех этапов и процедур исследования от момента сбора биологического материала до интерпретации.

При диагностике вирусных инфекций дыхательных путей информация о количестве возбудителя не имеет большого значения: с одной стороны, концентрация возбудителя в респираторных мазках весьма условно свидетельствует о тяжести заболевания, и с другой стороны, больше зависит от способа и правильности получения биологического материала. В связи с этим, более затратные количественные тесты не имеют большого смысла, поэтому не востребованы. Преимуществом могут пользоваться тесты, обеспечивающие большую мультиплексность анализа, то есть возможность обнаруживать большое количество значимых возбудителей в одной ПЦР при приемлемой чувствительности.

5.4. Этапы проведения ПЦР

Непосредственно ПЦР-исследование состоит из нескольких этапов:

  • экстракция НК (РНК / ДНК) из образцов исследуемого биологического материала,
  • в случае если геном возбудителя представлен РНК, требуется проведение реакции обратной транскрипции (ОТ) для получение кДНК,
  • амплификация ДНК (или кДНК)при помощи специфичных к гену-мишени праймеров и фермента Taq-полимеразы,
  • детекция, анализ и интерпретация результатов,
  • регистрация результатов.

На этапе экстракции исследуемый образец обрабатывается лизирующим раствором,в результате чего происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. Поскольку качество ПЦР зависит от чистоты выделенных НК, с целью очистки (устранения ингибиторов ПЦР) используются различные методы экстракции НК, включая автоматизированные. Один из методов основан на принципе неселективного или селективного прикрепления НК к сорбентам с последующей отмывкой и элюцией НК с сорбентов в буферный раствор. Существуют варианты с использованием сорбентов, содержащих частицы железа; в таком случае фракционирование возможно с применением магнитных штативов или автоматических станций. Сорбция также может проводиться на мембраны специальных колонок при центрифугировании раствора, содержащего НК,или при помощи вакуумного насоса. В основе другого метода выделения лежит принцип высаливания (выпадения в осадок) НК из растворов при добавлении спиртов в присутствии солей в высокой концентрации. Экстракция РНК из исследуемого материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО), что позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца на всех этапах. Внутренний контроль может быть экзогенным (в этом случае препарат ВКО добавляется в исследуемый образец на этапе экстракции) илиэндогенным (в реакции ПЦР используются праймеры для амплификации геномной ДНК/РНК человека). Для ПЦР-исследования образцов для выявления возбудителей, геном которых состоит из РНК, используется препарат ВКО, представляющий собой молекулу РНК, защищенную оболочкой белка. На этапе экстракции получают РНК ВКО, затем проводится получение, амплификация кДНК ВКО и его детекция. Описание примера работ по экстракции РНК/ДНК приведены в приложении 5.

Реакция обратной транскрипции может проводиться в двух вариантах: как отдельный этап или совмещенная с амплификацией. Если ОТ проводится отдельным этапом, для инициации синтеза кДНК на молекулах РНК используютсягексамеры случайной последовательности (рэндом-праймеры), фермент обратная транскриптазаи другие специальные реагенты. В результате такой реакции образуется кДНК на основе матриц всех РНК, присутствующих в растворе, полученном на этапе экстракции НК из исследуемого образца. В случае, если ОТ совмещена в одной реакции (программе) с ПЦР, реагенты для ОТ входят в состав подготовленной смеси для амплификации, к которой добавляют РНК; в результате образуется только кДНК, синтез которой инициируется участвующимв ПЦР праймером. Первый вариант более удобен при необходимости проведения большого количества ПЦР (более трех): в диагностических целях для обнаружения широкого спектра возбудителей для каждого пациента, при проведении эпидемиологического мониторинга, при расследовании случаев группового заболевания или выяснения этиологии тяжелого (атипичного) или летального случая, а также при необходимости последующего субтипирования положительных образцов (например при гриппе). кДНК более стабильна, по сравнению с РНК, иможет более длительно храниться без замораживания: при температуре от 2 до 8 °С в течение недели (при условии проведения ОТ в пробирках, имеющих специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free», или в подвергшихся автоклавированию), и более длительно при температуреот минус 24 до минус 16 °С в течение 6 месяцев или при температуре не выше минус 68 °С в течение года. Допустимо однократное повторное замораживание кДНК. При необходимости хранения РНК, не позднее 30 мин после экстракции ее следуетперенести в стерильные пробирки и хранить до 4 ч при температуре от 2 до 8 °С, при температуре не выше минус 16 °С в течение месяца, и более длительно при температуре не выше минус 68 °С, при чем повторное замораживание РНК не допускается.

Отдельный этап ОТ также удобен в случае подозрения на инфекцию, вызванную возбудителем второй группы опасности (ТОРС, высокопатогенный грипп птиц), когда манипуляции с биологическим материалом (предварительная обработка, экстракция НК) и ОТ проводятся в помещениях, оборудованных для работы с возбудителем второй группы опасности, а далее кДНК, при необходимости, может быть передана для проведения ПЦР в помещения, оборудованные для работы с возбудителями III-IVгруппы опасности. Пример методики проведения реакции обратной транскрипцииприведен в приложении 6.

Для диагностики ОРВИ применяются варианты ПЦР, различающиеся способомдетекции фрагментов амплификации: ПЦР с детекцией методом электрофореза, с флуоресцентной детекцией с использованием интеркалирующих красителей, с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с использованием конъюгированных с флуоресцентной меткой зондов в режиме реального времени (ПЦР-РВ, или FRT) и по окончании ПЦР (ПЦР-КТ, или FEP). Описание методик ПЦР с различными вариантами детекциипродуктов амплификации приведен в приложении 7.

Из всех вариантов наибольшую специфичность и возможность мультиплексирования (обнаружения в одной реакции нескольких генов-мишеней различных микроорганизмов) обеспечивает гибридизационно-флуоресцентная детекция с использованием конъюгированного с флуоресцентной меткой зонда, который присутствует в составе реакционной смеси игибридизуется с комплементарным участком амплифицируемой кДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала при использовании формата ПЦР-КТ осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, а при использовании формата ПЦР-РВ–непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» с двумя – шестью оптическими каналами. Специфичность амплификации также обеспечивается «горячим стартом», когда реакция начинается не ранее этапа денатурации НК при разделении ее компонентов восковой перегородкой, которая плавится при 95°С, либо использованием химически модифицированных Taq-полимераз, активирующихся при прогреве реакционной смеси при 95 °С.

Анализ результатов различается в зависимости от варианта ПЦР. Описание анализа результатов для методик ПЦР с различными вариантами детекцией продуктов амплификации приведен в приложении 7.

Для некоторых вариантов ПЦР требуется дополнительное оборудование (например, для детекции флуоресценции при ПЦР-КТ и разделения ДНК методом электрофореза, визуализации ДНК в агарозном геле). ПЦР в формате детекции продуктов амплификации методом электрофореза требует особых мер предотвращения контаминации (ложноположительных результатов), достигаемых проведением специальных мероприятий и соблюдением особых правил организации лаборатории согласно МУ1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе сматериалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для правильной интерпретации результатов обязательно использование положительных и отрицательных контрольныхреакций для всех этапов анализа. С целью упрощения и ускорения этого этапа можно использовать специальное программное обеспечение, рекомендованное производителем конкретного диагностического набора реагентов.

По результатам анализа в лаборатории выдают ответ о наличии в пробе специфических фрагментов ДНК или РНК генома возбудителя инфекционного заболевания. Результаты ПЦР-исследования должны учитываться в совокупности с результатами других методов в комплексной диагностике заболевания.

6. Контроль качества лабораторных исследований

Организация качества лабораторных исследований обеспечивается внедрением системы управления качеством (менеджмента качества, СМК) в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и ГОСТ Р ИСО 15189. Система управления качеством предусматривает внутренние контрольные процедуры и внешний контроль. В рамках организации контроля качества большое внимание необходимо уделять разработке и внедрению на рабочих местах стандартных операционных процедур (СОП). С целью предотвращения появления недостоверных, в том числе ложноположительных результатов, необходимо соблюдать требования по организации лаборатории, правила работы персонала с оборудованием и реактивами, и требования, указанные в инструкции и методических рекомендациях производителей конкретного набора реагентов.

6.1. Внутрилабораторный контроль качества

Внутрилабораторный контроль представляет собой систему внутрилабораторных сличенийполучаемых в лаборатории результатов. Для этого в каждой серии (постановке) тестируются контрольные образцы: ОКО, К+ и К–. Для внутрилабораторного контроля качества исследований рекомендуется использовать содержащие выявляемые организмы (или их НК), контрольные образцы, прошедшие государственную регистрацию в установленном порядке и разрешенные к применению на территории РФ (при их наличии).

Обеспечение внутреннего контроля качества проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и с инструкциями используемых наборов реагентов.

Внутрилабораторный контроль включает следующие специализированные процедуры:

  • постоянная оценка контрольных образцов в каждой постановке (серии) амплификации,
  • периодическое проведение повторного испытания (выполняется двумя операторами параллельно при смене оборудования, специалиста, введении нового набора реагентов),
  • использование контрольных образцов для внутрилабораторного контроля качества (данный вид контрольных процедур рекомендуется проводить при входном контроле наборов реагентов, смене оборудования, специалиста, введении нового набора реагентов),
  • контроль загрязнения лаборатории продуктами амплификации, проводится ежемесячно согласно процедуре (приложение 9).

Для контроля за контаминацией лаборатории продуктами амплификации необходимо проводить тестирование смывов не реже 1 раза в неделю в соответствии с МУ1.3.2569-09 согласно приложению 8.

В случае получения постоянных положительных сигналов в отрицательных контролях все исходные реактивы подлежат немедленной замене, необходимо провести деконтаминационные мероприятия в соответствии с МУ 1.3.2569-09.

6.2. Внешний контроль качества

Внешний контроль качества осуществляется в форме участия в межлабораторных сличениях. В случае неудовлетворительной оценки полученных результатов в лаборатории необходимо принимать экстренные меры по устранению ошибок.


Разработчики

  • ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии»Роспотребнадзора, Москва
  • С.Б. Яцышина, М.Г. Творогова, Г.А.Шипулин, В.В. Малеев
  • Ответственный разработчик: Ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины»

Рецензенты

  • Захарова Юлия Александровна - заведующая клинико-диагностической лабораторией, Пермского клинического центра ФМБА России, доктор медицинских наук, г. Пермь
  • Девяткин Андрей Викторович - Главный внештатный специалист по инфекционным болезням, главный врач ГБУЗ«Инфекционная клиническая больница No1 Департамента здравоохранения города Москвы», доктор медицинских наук, г. Москва

Полная версия статьи